【视频】冰岛，人类的终极孤独-江湖报
来源:时差岛
性冷淡，已远不够定义冰岛
看起来，它更像身患孤独绝症
冰岛，1000年的孤独感
大老远来冰岛旅行，
如果你不是诗人、导演或科学家，
那多半是着迷于它风景的荒芜感，
就像「冰岛」这个名字一样迷人。
老欧洲人嫌弃冰岛，实在荒得一无所有，
曾经，它也是北欧五国里存在感最弱的。
然而这些年，冷冷的冰岛火了！
这并不是一个咸鱼翻身的故事，
它其实什么也没做。
▲一驾美国空军飞机残骸是冰岛的热门拍照地。1973年坠毁，由于维修费用太贵，它就一直寂静地留在冰岛这一角。
▲飞机残骸在南岸的黑沙滩上，若想和它合影，需步行8公里荒野。Google坐标63.459523,-19.364618
我们为什么对冰岛着迷？
朋友圈里，玩冰岛的常常是你身边挺有品、也舍得花钱的那拨人。
画风清奇的瀑布，超然骨感的冰山，寸草不生的荒蛮大地……对看惯了超高饱和度、鲜亮甜腻的风景的我们来说，这种忧郁孤独的气质，太对胃口了！
岛主有一位单身美女设计师朋友刚去了冰岛，赞叹着说：在这样的地方旅拍，多酷啊！高级灰的调调，看着就不像在地球。而且自动屏蔽英法意德比五国游、东南亚串烧游那种大妈团……
旅行攻略帖最爱用「地球上最像外星球的地方」、「世界尽头的冰与火」这类标签来贴冰岛。《星际穿越》、《普罗米修斯》、《权力的游戏》这些取景冰岛的外星球魔幻电影，是不少国人对冰岛的第一印象。
「冰岛长得不像地球」倒是事出有因，当年美国航空航天局NASA为了培养登月宇航员，在全世界寻找一块看上去像月球的地方，全世界230多个国家和地区中，冰岛被选中了。
所以，如果你觉得这辈子都没空去月球的话，
那就去冰岛吧。
▲彩色条纹山脉Landmannalaugar，肌肤犹如油画颜料的山脉，冰岛本地人喜欢在此徒步。
▲冰岛火山众多，景观稀世震撼。
▲冰岛沼泽、河流等大地肌理。
很多陷入三十岁恐慌的人偏爱去冰岛「间隔年」一下。
当有一天你抑郁了、孤独了，却发现：
冰岛比你更抑郁，更孤独！
以毒攻毒，心情也就豁然了。
冰岛几乎所有被惊叹的审美，
都源自它的「一无所有」。
你想要的极品瞳术 ，恰好就是这一味孤独剂。
冰岛，人类的终极孤独
从长远来看，地球就是宇宙中的冰岛。
总有一天，地球也会像冰岛一样，
成为一个孤立无援，资源耗尽的地方。
冰岛的今天，就是我们的明天。
——袁越《土摩托看世界》
冰岛形成于2000万年前，是一个非常年轻的火山岛。它的国土面积和韩国差不多,但岛上100多座活火山，就够冰岛人受了。
冰岛只有33万人，比不上北京东城区人口的一半。但每年探访冰岛的游客量却比它本国居民多出了3倍！戏算起来，3个外国人（包含0.9个中国人）养活了1个冰岛人。
冰岛没有一颗树…
森林覆盖面积只有可怜的1%，光秃秃的山，平原看不见一棵像样的树（嗯，不像样的树还是有几棵）。火山频发，土壤沙化严重陈训秋，连草都稀松。缪海梅冰岛人过日子，「春暖花开，绿树成荫」就别想了。
▲冰岛中部、南部火山地区，满眼的硫磺石灰岩、苔藓、荒土。
四周环海，又没有树，所以2-4月旅行冰岛，你恐怕要品尝「二月春风似刮胡刀」的滋味。十级狂风暴雨的黑沙滩是另一种常态美！来，了解一下↓
这一「先天不足」歪打正着地造就了冰岛极像外星球的名声，诞生了一众震撼非凡的地貌奇观。火山、瀑布、地热温泉、间歇喷泉、海岸荒岛、远古冰川，是旅行冰岛的魔幻六部曲。
▲冰岛多山，瀑布变成了冰岛独特的景观，极具能量和美感。图为上镜率颇高的斯科加瀑布Skógafoss。
冰岛连庄稼也长不出…
阳光紊乱加上耕地匮乏，使得冰岛是一个完全没有农业的国家。
早期冰岛人就能靠捕杀海洋动物为食。海鸟没了，就猎海豹，海豹没了，就冒险出海捕鱼。好在海洋足够大，鱼一时半会儿吃不完，于是渔业就成了支柱。老冰岛人就是靠贩卖咸鱼赚些钱，再从欧洲人那里换回点口粮。
▲在古代，出海太危险了，于是冰岛渔民有个传统，就是父子绝不同时出海，防止断子绝孙。
冰岛连海滩也是黑黑的…
▲冰岛的沙滩基本都是黑色的，最著名的黑沙滩当然要数位于维克小镇附近的Reynisfjara。
▲黑色沙砾因千百年火山运动而形成。缥缈阴郁的气质，多了几分超现实感。
冰岛的火山不睡觉…
冰岛人不但要应对自然资源的匮乏，还必须时刻提防每五年一次的火山大爆发——这个国家有100多座活火山啊！对环境和生物杀伤力之大。至于地震就更是家常便饭了。
2010埃亚菲亚德拉冰川（Eyjafjallaj?kull）爆发，使冰岛在国际媒体中名声大噪，这勉强称得上因祸得福吧。
德国纪录片大师沃纳·赫尔佐格2016年拍摄了纪录片《进入地狱》，冒死置身于印尼、冰岛、埃塞俄比亚等地的火山口，近距离拍摄熔浆爆发的原始威力，一幅幅炼狱末世奇观，令人震撼。
既然失眠御井烹香，索性燥起来…
无奈的冰岛人索性变灾为宝，于是冰岛成了世界上唯一允许旅行者进入火山内部岩浆库参观的国家。
躁动的火山让冰岛的地热资源超丰富，它是全世界天然温泉数量最多的国度，足有200多处。冰岛人一年四季都爱泡温泉，所以很少有胖子。
最著名的蓝色泻湖（Blue Lagoon）位于首都近郊，是冰岛旅游的金字招牌，温泉呈牛奶般的蓝色，水温是完美的38℃。旅行时，当心那些滑溜溜的桥，记得多带护发素哦！
▲蓝色泻湖（Blue Lagoon）是朋友圈必晒的场景！
丰富的地热还给冰岛人带来一个意外之喜——间歇喷泉（Geyser），冰岛是欧洲大陆唯一拥有这神奇景象的地方王羽尧。
冰岛现在最为著名的间歇泉是斯特洛克（Strokkur）,在首都东北方向，每隔五六分钟喷发一次，水柱高达十几米。不过之前还有一个更厉害的大盖瑟（The Great Geysir），能喷二十多米高，后因地震停止了喷射。
于是，冰岛人玩起了黑色幽默…
冰岛有个叫Enjoy Oour Nature的本土避孕套牌子，拿冰岛特有的间歇喷泉、火山、极光做文章，妙处堪比杜蕾斯。
冰岛人用这种非主流的黑色冷幽默，来回应大自然的美意…
▲巨型石头、火山、北极光、地热喷泉、地热温泉、黑沙滩，这六大冰岛奇观被冰岛人玩坏了。
像样的太阳也没有…
身处北极圈，冰岛日照变化实在是太诡异！夏天能有20小时白昼，太阳刚落山就又日出了。但到了冬天就只有4-5小时白天，几乎整天都是黑的，「夜生活从中午11点就开始了，冰岛人不抑郁才怪」。
生活没有阳光，精神世界就需要更多物质来填满。
漫长黑夜搭配黑暗冷笑话、黑暗料理吧！夜幕降临，年轻人们要么泡酒吧，要么整天宅，这恰好催生了冰岛发达的文学和音乐。冰岛人均购书量全世界最多，即便他们只有可怜的「全国4家报纸、12本杂志」。
▲作为世界上最靠北的首都，雷克雅未克是冰岛唯一一个可以称得上是城市的地方，80%的冰岛人生活在这座城市。
虽然太阳不给力，但冰岛并没有你想象中那么冷。因为大西洋暖流的赏脸，冰岛远比同纬度其他地方——比如美国阿拉斯加、或更低纬度的中国哈尔滨要暖和。
▲首都最高建筑就是高达72米的哈尔格林姆大教堂，冰岛人做礼拜、举办婚礼、葬礼的地方。
▲教堂前立着冰岛探险家雷夫·埃里克森（Leifr Eiricsson）的雕塑，人们都说，最早发现美洲的不是哥伦布，而是这位冰岛人。这尊雕像就是美国政府为了纪念埃里克森发现美洲1000周年，于1930年送给冰岛的礼物。
冰岛1号公路…没有2号
冰岛没有火车，没有地铁，虽然有公共巴士，班次却很少。一共就30多条公路，除了1号公路，就是两位数、三位数、带头字母F的了……所以想环岛自驾或骑行，沿1号公路一直下去就是最佳、也是唯一选择了。
▲这条「环岛公路」约1336公里，8-10天自驾时间，能深入走完这个国家的精华景观。
▲冰岛1号公路，许多路段是单车道。
冰岛还有一条1-2天的小圈环线——黄金环线（The Gold Circle）,大多数第一次来冰岛的旅行者都会选择这条线路，到达冰岛最著名的三处自然奇观——黄金瀑布（Gull Foss）、间歇泉（Geysir）和辛格韦德利国家公园（Pingvellir National Park）。
▲沿1号公路从首都出发，在南部火山形成的韦斯特曼纳群岛（Vestmannaeyjar）看冰岛国鸟海鹦李汝革。
▲东行到达Skaftafell冰川公园，你能看到除北极、格陵兰岛之外世界最大的冰原。
▲著名的蓝冰洞,必须提前预约，每次大约只有200人有机会进入到瓦特纳冰川的冰洞穴进行观赏。
▲沿途经过霍芬，这是你离开首都后难得一见的「大城镇」。
▲一路向北，西峡湾（The Westfjords）将冰岛的旖旎风光达到登峰造极的地步——大众旅游在这里无影无踪。斯奈山半岛（Snaefellsnes）草帽山是西部峡湾的明星景点朱以庄 。
▲最北部的格里姆塞岛(Grímsey)，是冰岛唯一位于北极圈内的领土。
冰岛缺人，连首相也兼职…
有趣的是，如此严酷的生存环境，冰岛人寿命反倒很长，男性平均寿命78.9岁是世界之最，女性平均寿命更长，82.8岁。男女超级平等，1980年选举产生了全球首位女总统，还是一位单亲妈妈——维格迪丝·芬博阿尔蒂。
但即便如此，冰岛人才依然紧缺，所以冰岛人是全球终极多面手也是被逼的……许多冰岛人都有第二职业，比如前首相也是诗人，前外交部长兼任理疗医生，率领冰岛男子足球队创造世界杯、欧洲杯奇迹的主教练还是一名牙医。
冰岛电视台想要举办《创造101》这类选秀节目，全冰岛人得全体出动啊，并且，一季结束还要愁下一季，哪儿去找那么多新选手啊。
「他们居然能建立一个国家，这是多么了不起。」
冰岛简史，读起来也好惨…
历史上，冰岛第一代移民是挪威维京海盗，这是一帮亡命徒，无意间发现了这座无人岛，带着从苏格兰和爱尔兰抢来的凯尔特女人，在公元874年（中国唐朝年间）登岛定居。现代冰岛人都是当年这批海盗的后代，人种相当纯洁。
维京人上了岛，没国王，没军队……于是散落在冰岛各地的移民决定召开一次大会，制定一份像样的法律。这是冰岛人最为骄傲的地方，因为这里诞生了人类历史上第一个民主议会。
当年开会的地方，就是今天辛格韦德利国家公园的古议会遗址Thingvellir，这也是冰岛唯一一处世界文化遗产。
▲图中的几排白房子就是当年古议会遗址，冰岛人特意在它周围种了几棵树，不容易！
随后几百年，小岛日子还算太平，但13世纪冰岛爆发了内战，不得不把挪威国王请来管自己。后来，冰岛又被丹麦人统治了682年。1944年虽然独立了，但二战后，冰岛实际上被美国统治着，美国军队基地一直保留到2006年。
2008年金融危机，冰岛不幸破产了。所有冰岛人都迷失了方向。冰岛作家、诺贝尔文学奖获得者Halldor Laxness曾说过这样一句话：当一切都结束后你会发现，人生最重要的东西就是咸鱼。
唯一的好消息是，冰岛克朗贬值反而给旅游业注入了一剂兴奋剂。
国家小，翻身快，冰岛人靠美国人、俄罗斯人支持，靠旅游业、老行当的渔业，外加少量副业，很快变成了全球人均GDP、世界幸福指数排名靠前的富裕国家。
现在，冰岛人可以昂首挺胸了。
▲雷克雅未克街头年轻人的画风，冰岛羊毛衣是冰岛最受欢迎的纪念品之一。
冰岛人，你孤独吗…
几个世纪的苦难，让冰岛人变得超能扛、且抱团！生活环境极端险恶，若不抱团，只有死路一条。有时也让外界觉得他们顽固不化，但你稍微了解下就能懂：这么小个国家，真的经不起折腾。
2016年欧洲杯，冰岛足球队奇迹般地赢了英格兰打进8强，那一刻，他们集体爆发出的那种呐喊，像憋了一千年的火山。冰岛球迷赛后奉上的「维京战吼」燃爆全球，这段视频成为当年英国推特点击量的年度冠军。每一声「Ahu！」都震慑人心，嗯，维京祖先附体了↓
▲2016年欧洲杯，火遍全球的冰岛球迷「维京战吼」。
你无可否认，这孤独的力量无穷！
旅行时，我们遇到的冰岛人都很Nice，努力工作，超级热情——据世界经济论坛2013年排名，它是140个国家里最热情的。
但毕竟是维京海盗的后代，并不像其他北欧人温文尔雅，自带野性，就像一匹假装被驯服的野马。
冰岛语和几千年前的维京语几乎没差，现在的冰岛年轻人都会说好几门外语，大概是从小就知道，冰岛太小了，要走向世界，得先学会别人的语言。
冰岛现在到处都是中国游客，当地一美女导游和我们套近乎，还说要用古老的冰岛语献唱一首中国歌——我们完全被shock到了，竟然是《小苹果》
从冰岛人的角度看世界，你就很能理解了——冰岛人总说自己很有安全感，很幸福，他们一边咀嚼着苦涩的鲸鱼肉和熏海雀、连续3个月见不到太阳、每天十级狂风、经常性地震火山，然后，再给你一个谜之微笑，说：「现在张承禹，我们已经感觉很幸福、很满足了。」
大概，没有谁比冰岛人更懂得享受孤独了。
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打赏
摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线? 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取漂泊信天翁，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNAforward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggtggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactgaccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%)Total RNAs Percent (%) Total39,813100 6,194,289100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA2,1245.33 22,289 0.36 snoRNA190.05 1830.00 other10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,14440.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从?20.10到?99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。 图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70安吉实验初中 , cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved NovelConserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40miR-1992爱团网, miR-2b, miR-34,Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1)miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言 目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司； 三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf,天赐良儿演员表 USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO 酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1oC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。 (4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8李赞熙，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega
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